【儀表網 儀表研發】囊泡胞吐作用是一個快速的動態過程，通過控制囊泡包裹的活性肽或神經遞質向細胞外部釋放，從而調節重要的生理功能。目前對囊泡胞吐的檢測技術主要包括電生理和光學成像的方法。基于膜片鉗的電生理檢測技術可以對單個細胞的胞吐事件進行檢測，該技術的主要優勢是操作的時間分辨率高，可在毫秒尺度上檢測單個細胞中囊泡的胞吐事件。然而，電生理檢測技術主要用于離體單個細胞或腦片中單個細胞的檢測，較難實現多個細胞的同時檢測及在體監測。另外，膜片鉗技術檢測的是單個細胞中多個囊泡胞吐的表觀事件，無法對單個囊泡的錨定和融合過程進行觀察和檢測。而基于光學成像的檢測技術可以同時對多個細胞中的囊泡胞吐事件進行追蹤和記錄，該技術還可以對單個囊泡的胞吐事件進行檢測，這對于在分子水平揭示囊泡與質膜錨定、融合的調控機理十分重要。在此過程中，熒光蛋白融合標記為顯微成像提供了有力工具。與可透膜的熒光染料相比，熒光蛋白成像背景低、信噪比高、生物毒性低、表達量可控，是活細胞成像的首選。
 

　　成熟的囊泡腔內為酸性pH環境(pH約為5.6)。囊泡胞吐時，囊泡膜與質膜發生融合，腔內pH瞬間切換為偏堿性的細胞外環境(pH約為7.4)。基于此特性，科學家通過氨基酸突變及篩選，最終獲得pH敏感型GFP突變體pHluorin，目前已被廣泛用于檢測突觸囊泡、分泌小泡和再循環內體的胞吐作用。然而，由于發生膜融合前，位于質膜附近囊泡內的pHluorin熒光信號弱，限制了其追蹤囊泡錨定步驟的應用。此外，現有的紅色pH敏感熒光蛋白探針與pHluorin相比，pH敏感性相差甚遠。其中，pHuji的性質相對較好，但該蛋白熒光強度低且具有快速的熒光衰減特性，其熒光強度在<2s的連續照明下即降到初始熒光的35%，不適合囊泡分泌檢測和動力學跟蹤。
 

　　中國科學院生物物理研究所研究員徐平勇課題組在Nature Communications上，發表了題為pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps的研究文章。該研究開發出一個亮度高、穩定性好、pH敏感性強的紅色熒光蛋白探針pHmScarlet。該探針在現有紅色熒光蛋白中具有最高的pH敏感性，能檢測到更多的分泌事件，并且可同時可視化分泌事件中的囊泡錨定和融合步驟。在用于囊泡分泌事件檢測時，pHmScarlet具有與綠色pH敏感熒光蛋白pHluorin媲美的分泌信號。此外，pHmScarlet還具有pHluorin不具備的檢測能力。pHmScarlet的pKa值使得其在酸性條件下可檢測完整囊泡中的熒光強度，實現對囊泡錨定步驟的追蹤和記錄。該探針還可以與pHluorin結合，對多個囊泡蛋白進行雙色成像。此外，盡管pHmScarlet的發射波長與pHluorin相比明顯紅移，但其空間分辨率足夠高，可以使用Hessian結構光照明顯微鏡(Hessian-SIM)進行超高分辨率成像，解析出囊泡融合孔的環形結構。可以預測，該pH敏感紅色熒光蛋白探針將在囊泡分泌與運輸領域有更廣泛的應用。
 

　　該研究由中科院生物物理所、北京大學、中科院遺傳與發育生物學研究所等合作完成。研究工作得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金、中科院戰略性先導科技專項，以及中科院科研儀器設備研制等的