近日，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、北大成都前沿交叉生物技術(shù)研究院王初課題組在Journal of the American Chemical Society雜志上發(fā)表了題為“Discovery of Cysteine Carboxyalkylations by Real-time Isotopic Signature Targeted Profiling”的文章。在這項(xiàng)工作中，作者開發(fā)了名為isoSTAR(isotopic signature targeted profiling)的基于特殊同位素信號(hào)的質(zhì)譜靶向檢測(cè)新方法，并利用此方法發(fā)現(xiàn)了脂肪酸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一系列新型半胱氨酸羧甲基化修飾(Cysteine Carboxyalkylations)。
 

　　基于特殊同位素信號(hào)開發(fā)靶向質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)脂肪酸代謝中產(chǎn)生的新型半胱氨酸羧甲基化修飾

 

　　數(shù)據(jù)依賴性采集(Data-Dependent Acquisition，DDA)是基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)中最常用的檢測(cè)方法之一，然而由于質(zhì)譜掃描速度的限制，其僅會(huì)按強(qiáng)度由高到低順序選擇部分肽段離子進(jìn)行碎裂及二級(jí)譜掃描，導(dǎo)致強(qiáng)度較低的肽段離子很難被檢測(cè)到。王初課題組此前曾開發(fā)了基于硒同位素的靶向組學(xué)分析方法SESTAR(doi: 10.1021/acscentsci.8b00112)和SESTAR++(doi: 10.1016/bs.mie.2021.10.013)，可以在質(zhì)譜一級(jí)譜數(shù)據(jù)中選擇性識(shí)別出可能含硒肽段的同位素信號(hào)，從而提升含硒肽段的鑒定效果。然而此方法需要兩輪質(zhì)譜檢測(cè)才能完成，會(huì)造成檢測(cè)時(shí)間及樣品的浪費(fèi)，并且因兩次檢測(cè)間的不平行造成通量減少甚至靶標(biāo)丟失。在該工作中，作者利用儀器公司提供的質(zhì)譜控制接口IAPI，在SESTAR基礎(chǔ)上開發(fā)出了名為isoSTAR的質(zhì)譜檢測(cè)流程。isoSTAR利用快速同位素特征識(shí)別算法對(duì)靶標(biāo)肽段特殊同位素信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)識(shí)別，并立即向質(zhì)譜發(fā)出靶向掃描請(qǐng)求，從而可以一步直接對(duì)低豐度靶標(biāo)肽段進(jìn)行深度的靶向檢測(cè)。
 

　　經(jīng)過(guò)測(cè)試，isoSTAR相較于DDA及DDA+SESTAR具有更低的檢測(cè)限及對(duì)靶標(biāo)肽段更好的檢測(cè)效果。隨后作者結(jié)合了isoSTAR與開放式搜索技術(shù)開發(fā)了代謝過(guò)程引發(fā)新型翻譯后修飾的發(fā)現(xiàn)流程。基于代謝過(guò)程中有許多翻譯后修飾相關(guān)的前體及活性中間體，此流程中利用了內(nèi)源代謝物的生物正交類似物探針進(jìn)行代謝標(biāo)記，隨后利用帶有輕、重甘氨酸1：1混合的脫硫生物素富集標(biāo)簽“GG tag”進(jìn)行特殊同位素信號(hào)的引入及富集，再使用isoSTAR對(duì)富集的修飾肽段進(jìn)行靶向檢測(cè)。在通過(guò)開放式搜索技術(shù)分析出肽段信息及PTM的質(zhì)量偏移后，最終利用一級(jí)譜及二級(jí)譜上的特征同位素信號(hào)篩選出可信的翻譯后修飾進(jìn)入后續(xù)驗(yàn)證流程。
 

　　長(zhǎng)鏈脂肪酸及短鏈脂肪酸相關(guān)的翻譯后修飾有較多報(bào)道(例如棕櫚?；鞍投辊；?，而中鏈脂肪酸相關(guān)的翻譯后修飾則鮮有報(bào)道。作者利用中鏈脂肪酸類似物辛炔酸對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了代謝標(biāo)記，并利用“GG tag”進(jìn)行特殊同位素信號(hào)的引入及富集，再利用isoSTAR進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。進(jìn)行開放式數(shù)據(jù)搜索后，作者發(fā)現(xiàn)了在半胱氨酸上的兩種新型PTM，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證這些PTM是β-氧化過(guò)程中間產(chǎn)物α, β-不飽和脂肪酸與半胱氨酸巰基發(fā)生邁克爾加成的產(chǎn)物，作者將此修飾命名為半胱氨酸羧甲基化修飾。在更接近生理環(huán)境的條件下，作者也成功發(fā)現(xiàn)了脂肪酸β-氧化代謝中間產(chǎn)物對(duì)半胱氨酸修飾造成的一系列羧甲基化修飾，證明了新型半胱氨酸羧甲基化修飾在生理或病理環(huán)境下的存在。
 

　　王初為該論文的通訊作者，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院博士生賈國(guó)賡、劉亦成及馮天宇為本文的共同第一作者。張子璇、唐歡、楊帆、高晉君等為此工作的完成作出了重要貢獻(xiàn)。該工作得到了科技部重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金、北京分子科學(xué)國(guó)家研究中心、北京大學(xué)AI4S專項(xiàng)等項(xiàng)目的支持。